如何通过原位精准编辑大幅增强目标基因的表达？2024年7月23日，正规网赌十大排行网址陆钰明教授课题组联合南方科技大学朱健康院士团队，在Molecular Plant在线发表了题为“Efficient and multiplex gene upregulation in plants through CRISPR/Cas-mediated knock-in of enhancers”（https://doi.org/10.1016/j.molp.2024.07.009）的研究论文。该研究将全新的全基因组增强子挖掘技术（STEM技术）与基因敲入技术结合，在植物上建立了一种可通用（30+各类基因的激活）、可设计（3-1000倍增强）、可遗传（>T3代的验证）的基因激活技术。通过一次敲入实验，该技术进一步实现了对整个NMN代谢通路多达4个基因的同时激活，首次将植物内源性NMN含量提升了2-3倍，为基因过表达提供了一种替代转基因的通用解决方案。

基因表达的精准调控对于物种改良至关重要，通常依赖于转基因技术。随着CRISPR/Cas介导的敲入技术的发展，精确地在植物基因组中插入序列成为可能。如果能够实现有针对性地将增强子插入基因的启动子区域，实现直接增强转录的“原位激活”，则有望克服对转基因的依赖和随机性编辑的局限。但适合精确敲入的短转录增强子（STEs）的短缺限制了其在植物育种中的应用。符合监管政策的短序列、高效的内源性STEs的需求迫切，但目前相关研究非常有限

图1. STEM技术，实现STE的全基因组挖掘

区别于Starr-seq技术，该研究首先开发了一种名为STEM的一种高通量筛选增强子的方法。为了大规模地从物种基因组中筛选出具有不同调控能力的增强子，该研究提供了一种含条形码载体系统，将每个条形码与候选增强子元件一一对应，通过测量条形码的丰度，获得候选增强子元件的激活倍数。基于STEM，通过分析水稻基因组中关键候选基因的启动子区域，研究团队鉴定了11610个候选STEs，并利用条形码介导的RNA-seq分析，成功鉴定了122个来自病毒及水稻的短增强子，其中来自病毒的增强子最高能够达到1000倍的激活效果，来自水稻内源的增强子最高能够达到66.6倍的激活效果，其中最短的增强子长度为40bp，大多数集中在100bp。该研究通过体外实验确定了STE插入的最佳位置，发现越接近转录起始位点（TSS），增强效果越强。在水稻多个不同基因中进行的目标敲入实验中，实现了高达176倍和869.1倍的基因表达上调，且该上调效果在多代中稳定遗传。

图2. 高达1000倍的原位激活

此外，为了验证梯度激活的可行性，该研究选择了四个具有不同激活能力的STEs，包括来自病毒的STEvs011和STEvs007，以及水稻衍生的STEos026和STEos045。通过将这些STEs的供体DNA片段混合并转化水稻愈伤组织，研究人员成功获得了不同STEs插入的水稻T0代植株，并观察到EUI和RFT1基因表达的梯度上调。与此同时，研究人员还探讨了同时激活多个基因的可能性。以烟酰胺单核苷酸（NMN）生物合成途径为例，研究人员设计了六个相关基因的sgRNA位点，并构建了相应的CRISPR/Cas9质粒。通过单次转化，研究人员成功实现了多达四个基因的同时激活，并显著增强了NMN代谢途径。

该研究通过开发一种创新的全基因组筛选方法STEM，实现了短转录增强子（STEs）的高效筛选，并在水稻中成功应用了“原位激活”技术。此外，该研究证实了通过“原位激活”技术实现的基因上调效果在多代植物中具有稳定的遗传性，解决了传统转基因技术中常见的代际不稳定性问题，通过使用不同STEs实现了目标基因表达的梯度调控，通过单次转化实现多个基因的同时激活，这为复杂性状的精细调控和改良提供了新的可能性。该工作强调了对高效、短序列、具有特定活性的内源性STEs的进一步研究的必要性。未来通过探索STEs的时空特异性表达调控机制，将为植物遗传改良提供更为精确的工具。鉴于基因组编辑技术相较于传统转基因技术在监管政策上的优势，该研究为符合政策导向的作物改良提供了新的思路。

图3. 可设计、可遗传、多基因的原位激活

姚琦博士、沈润东博士和邵扬博士为共同第一作者，陆钰明教授和朱健康院士为本文通讯作者，田益夫博士、韩沛津博士、张学宁博士也参与了该研究。该研究得到了科技部重点研发计划青年项目、上海市农业科技创新项目和国家自然科学基金项目资助。

值得注意的是，陆钰明课题组也在今年5月份在New Phytologist发表了题为“In-locus gene silencing in plants using genome editing”的研究论文，成功开发了“原位沉默”技术。通过在5’UTR区敲入一种多功能调控元件ATGE，该方法可通过一次敲入实验，获得具有不同敲低程度的基因编辑材料，从而建立了一种高效率、可遗传、非转基因的新型基因沉默技术。结合该团队独特的敲入技术(Nature Biotechnology 38:1402)，其已成功建立了完全自主的基因编辑育种体系，实现了低至10%、高达1000倍，可通用、可设计、可遗传的基因原位调控。